菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種菌種分為母種(一級種)、原種(二級種)和栽培種(三級種)三級。
工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩，挑選具有某種能力的有用菌種。分離就是首先是從土壤或腐生植物中收集含菌樣品，用無菌水稀釋后，涂布于置有適宜細菌、放線菌或霉菌生長的瓊脂培養(yǎng)基平皿上，并將其倒置于恒溫箱中，培養(yǎng)一定時間，平皿上長出的許多單個菌落(單一微生物的集落)經(jīng)分別分離后即為各種純種菌株，簡稱純種，移種至試管斜面培養(yǎng)基上，置4℃冰箱備用。
菌種是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究。
1、梭氏法
將容有1滴細胞懸液的小管﹐置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中﹐用真空泵抽至1、3帕?xí)r﹐將大試管密封保存。這是為減少細胞死亡率而采取的一種不經(jīng)凍結(jié)﹑緩慢脫水的干燥保藏法﹐適用于多種細菌﹑真菌。
2、冷凍真空干燥法
將細胞懸液每0、1~0、2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預(yù)凍1小時﹐再于-20~30℃﹑真空度為13、3帕的條件下脫水。在脫水過程后期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水后的樣品含水量應(yīng)在3%以下。后﹐將安瓿瓶保持真空度1、3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細胞在凍結(jié)和脫水過程中損傷或死亡﹐要用保護劑制備細胞懸液。保護劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的長期保存﹐是當(dāng)前保藏菌種的一個重要方法。但是﹐鹽桿菌﹑發(fā)光桿菌﹑黏桿菌﹑阿舒囊霉﹑多囊霉﹑擔(dān)子菌中的大多數(shù)屬種不適用于此法保存。
3、液態(tài)氮超低溫凍結(jié)法
用甘油或二甲亞(DMSO)作保護劑制備細胞懸液﹐分裝入無菌安瓿瓶﹐每管0、2毫升﹐在控制溫度下降速率為1℃/分鐘的條件下預(yù)凍至-40℃﹐然后立即放入液氮生物貯存罐中氣相(-150℃)保存。恢復(fù)培養(yǎng)時﹐先直接侵入38℃水浴中解凍5~10分鐘﹐再種植于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。這是根據(jù)在低于-130℃時一切生化反應(yīng)處于停止?fàn)顟B(tài)﹑微生物也不能進行代謝活動而設(shè)計的凍結(jié)法。為避免凍死﹑凍傷和細胞內(nèi)形成大量冰晶﹐用保護劑制備懸液并控制預(yù)凍時的冷卻速率和解凍時融化速率。微生物的大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快速解凍。此法適用于病毒﹑枝原體﹑各種細菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌﹑藍藻等。
4、定期移植法
將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上﹐在適溫度中培養(yǎng)﹐至靜止期或產(chǎn)生成熟的孢子時﹐置入5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養(yǎng)和保存的過程中﹐由于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原菌的生活條件﹐結(jié)果菌落群體中的個體就不斷衰老和死亡﹐因此每5~15天或1~4個月重新移植一次﹐具體間隔時間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設(shè)備﹐但煩瑣﹐費時﹐而且經(jīng)常移植容易引起菌種退化。
5、礦油封藏法
將化學(xué)純的液體石蠟(礦油)經(jīng)高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分﹐然后注入斜面培養(yǎng)物中﹐使液面高出斜面約1厘米。將試管直立﹐放在15~20℃室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥﹐可以延長保藏的時間。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌﹑芽孢桿菌﹔不適用于固氮菌﹑乳酸桿菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛霉目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染。
6、沙土管法
將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然后將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)﹐可保存較長時期。此法適用于芽孢桿菌﹑梭狀芽孢桿菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。
7、麩皮法
將麩皮制成培養(yǎng)基﹐培養(yǎng)要保存的菌種﹐待生長良好后﹐置干燥器中保存。這是根據(jù)中國釀造酒﹑醋﹑醬時制曲的經(jīng)驗所采用的一種保藏方法﹐適用于谷物微生物區(qū)系中的種類。
8、L-干燥法
又稱液體干燥法或真空干燥法﹐用含3%谷氨酸鈉的0、1M磷酸緩沖溶液(pH7、0)做分散媒﹐將待保藏的微生物制成高濃度的細胞懸液﹐滴入無菌安瓿瓶中﹐每管0、05毫升﹔將安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶內(nèi)樣品溫度為10℃﹐在13、3~1、3帕的真空度下干燥﹐火焰封管保存。此法不經(jīng)凍結(jié)﹐用真實泵迅速抽乾﹐可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應(yīng)用于病毒﹑噬菌體﹑細菌﹑酵母菌﹑藍藻﹑原生動物等。
