禽腺病毒I群（FADV-I）PCR試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

禽腺病毒I群（FADV-I）PCR試劑盒常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

一、檢測(cè)結(jié)果異常

1.無(wú)目標(biāo)擴(kuò)增或擴(kuò)增效率低

●可能原因：

●核酸提取失敗（如樣本反復(fù)凍融超過(guò)5次導(dǎo)致DNA降解）  。

●試劑活性下降（未按-20℃保存或反復(fù)凍融超過(guò)5次）。

●PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤（如退火溫度未設(shè)為60℃）。

●解決方案：

●優(yōu)化核酸提取步驟，推薦磁珠法或離心柱法，確保DNA純度。

●檢查試劑保存條件，避免不同批次試劑混用。

●核對(duì)儀器參數(shù)設(shè)置，確認(rèn)擴(kuò)增程序?yàn)椤?5℃預(yù)變性5分鐘，95℃ 15秒/60℃ 30秒，循環(huán)40次"。

2.非特異性擴(kuò)增（假陽(yáng)性）

●可能原因：

●樣本間交叉污染（如未使用濾芯吸頭或未區(qū)分實(shí)驗(yàn)區(qū)域）。

●環(huán)境氣溶膠污染（實(shí)驗(yàn)臺(tái)未徹-底消毒）。

●解決方案：

●使用無(wú)菌操作技術(shù)，嚴(yán)格劃分樣本處理區(qū)、試劑配制區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。

●實(shí)驗(yàn)后用10%次氯酸或75%酒精消毒操作臺(tái)，廢液按生物危害物處理。

二、操作流程問(wèn)題

1.樣本處理問(wèn)題

●常見(jiàn)問(wèn)題：

●活禽泄殖腔拭子未置于50%甘油生理鹽水中保存，導(dǎo)致核酸降解 。

●組織樣本未低溫運(yùn)輸（推薦2-8℃冰袋保存），影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。

●解決方案：

●嚴(yán)格按規(guī)范保存樣本，活禽拭子需浸泡于50%甘油生理鹽水，組織樣本-20℃冷凍。

2.試劑配制誤差

●常見(jiàn)問(wèn)題：

●預(yù)混液未完-全溶解或混勻，導(dǎo)致反應(yīng)體系不均 。

●加樣體積偏差（如未按21μL預(yù)混液+4μL樣本比例配制。

●解決方案：

●使用前充分溶解試劑并短暫離心，避免氣泡干擾 。

●采用精準(zhǔn)移液器（如低吸附吸頭）控制加樣量。

三、儀器與數(shù)據(jù)分析問(wèn)題

1.擴(kuò)增曲線異常

●可能原因：

●反應(yīng)管密封不嚴(yán)導(dǎo)致蒸發(fā)（曲線呈鋸齒狀或不規(guī)則）。

●探針熒光衰減（未避光保存試劑或反復(fù)凍融） 。

●解決方案：

●檢查PCR管密封性，確保擴(kuò)增過(guò)程無(wú)液體損失。

●試劑避光保存，開(kāi)封后盡快使用。

2.結(jié)果判讀爭(zhēng)議

●常見(jiàn)問(wèn)題：

●閾值線設(shè)置不當(dāng)（需高于陰性對(duì)照熒光信號(hào)）。

●可疑樣本（Ct值35.0-38.0）未復(fù)測(cè)直接判讀。

●解決方案：

●調(diào)整基線參數(shù)（Start值3-15，Stop值5-20），手動(dòng)設(shè)定閾值線。

●對(duì)可疑樣本重復(fù)檢測(cè)，若復(fù)測(cè)Ct值仍≤38.0則判為陽(yáng)性。

四、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與驗(yàn)證

●質(zhì)控失敗處理：

●陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增：檢查試劑活性或儀器校準(zhǔn)（如FAM通道是否開(kāi)啟）。

●陰性對(duì)照出現(xiàn)Ct值：排查環(huán)境污染或試劑污染，重新提取核酸。

五、其他注意事項(xiàng)

●試劑盒適用范圍：僅限科研使用，臨床診斷需結(jié)合其他檢測(cè)方法。

●冷鏈運(yùn)輸要求：試劑需-20℃保存，運(yùn)輸時(shí)使用冰袋（2-8℃）。

建議：若問(wèn)題持續(xù)存在，可聯(lián)系供應(yīng)商獲取技術(shù)支持。