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登革熱IgM(捕獲法)ELISA檢測試劑的實驗步驟

更新日期: 2025-03-25
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DENV Detect IgM Capture ELISA是一種用來檢測人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測系統,它可以檢測出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗原(DENVRA)的IgM抗體。此診斷實驗用于有登革熱發熱或是登革熱血熱臨床癥狀的病人檢測。陽性結果必須經過蝕斑減少中和試驗(PRNT)或是根據CDC疾病診斷指南確證。
實驗步驟:
將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實驗前反復倒置以混合試劑和樣品。
試劑準備:
1)1X洗滌液的配制:用生物學或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖液,我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中,沖洗掉所有晶體,旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩定儲存6個月。使用前請檢查洗滌液是否被污染。
2)包被板的準備:將實驗所需數目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中,并儲存于2-8℃的環境下,有效期內穩定。
操作步驟:
1)陽性質控、陰性質控都必須做雙份檢測,DENRA和NCA都要檢測,未知血清樣品可做一份或雙份,DENRA和NCA都要檢測,按照說明書上的操作流程圖進行操作。
2)將實驗中使用的板條標記好。
3)用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進行稀釋,稀釋時至少需要4ul血清、陽性質控和陰性質控。如:4ul血清加396ul稀釋液。
4)用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質控和陽性質控各50ul加入到相應的微孔中。注意,所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測。
5)用封板膠僅在開放的微孔表面封板,所有板條的底部是沒有覆蓋的。
注意:這樣是為了保證溫度的分布在每個孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發,任何多余的封板膠必需被剪掉。
6)37℃下孵育1小時。注意:不要將微孔板疊放,必須單獨地分層平輔。這對于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體,不要讓板條接觸任何濕潤的物質,如濕紙巾等。
7)溫育后,用洗板機洗板6次,每次每孔300ul。
8)在A-D列中加入50ul DENRA,在E-H列中加入50ul NCA。
9)用封板膠僅在開放的微孔表面封板,所有板條的底部是沒有覆蓋的。(同步驟5)
10)37℃下孵育1小時。(同步驟6)
11)溫育后,用洗板機洗板6次,每次每孔300ul。
12)用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標記的酶聯物。
13)用封板膠僅在開放的微孔表面封板,所有板條的底部是沒有覆蓋的。(同步驟5)
14)37℃下孵育1小時。(同步驟6)
15)溫育后,用洗板機洗板6次,每次每孔300ul。
16)用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17)室溫下溫育(無需蓋板)5min。
18)溫育后,用洗板機洗板6次,每次每孔300ul。
19)用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20)室溫避光溫育10min。
21)溫育后,用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液,室溫溫育1min。
22)溫育后,450nm處測OD值。
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